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什么是miRNA
miRNA与癌症：诊断、预后及治疗前景
病毒与miRNA
其它miRNA/相关疾病
miRNA的治疗手段
miRNA检测方法
什么是miRNAa1
miRNA是一类长度为22个核苷酸左右的非编码调节RNA，它参与RNA介导的基因沉默。目前，人们已经鉴别出500多个人类miRNA。miRNA是重要的基因调节因子，它参与细胞分化、增殖、凋亡、胰岛素分泌以及心脏、大脑和骨骼肌的发育过程。具有基因沉默功能的成熟miRNA的产生过程需要经过若干步骤(见下图)。在RNA聚合酶II(polyII)或III的作用下转录而来的初级miRNA(primiRNA)，经过Drosha及DGCR8剪切形成miRNA前体(pre-miRNA)。然后，输出蛋白5(Exportin-5)将pre-miRNA从细胞核转运至细胞质。随后在细胞质内，pre-miRNA又被Dicer/TRBP进行第二次切割，最终成为在3'端有两个碱基突出的20nt左右的双链RNA。通常，上述双链RNA中的一条单链会与RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex, RISC)结合。也有一些miRNA双链会打开并分别与不同的RISC结合。RISC中的成熟miRNA链被称为引导链(guide strand)，相对应的另一条链被称为过客链(passenger strand)。最小的RISC至少包括下列物质：Argonaute (Ago)protein、Dicer以及TRBP，而RISC还可以和许多辅助蛋白相互作用。一旦成熟miRNA的guidestrand被装载进入RISC，它将会和其靶mRNA的 3' UTR结合，从而诱导沉默。目前普遍认为，miRNA及其靶mRNA结合的特异性主要由“种子序列(seed sequence)”(guide strand第2至第8个核苷酸，见下图)控制。已有证据表明，miRNA识别靶标mRNA序列的特异性并不是很高。有研究者指出，有一些miRNA的靶mRNA可以多达数百种。miRNA通过多种机制抑制其靶mRNA的表达。如果miRNA与其靶mRNA完全互补，那么就会导致mRNA的降解，但这在哺乳动物体内是少见的。通常，miRNA只与mRNA的3' UTR部分互补，进而阻止其翻译、脱甲基化帽子或脱腺苷化。
RNAi在基因沉默领域中的应用日益广泛，这主要包括两个方面：基因功能性研究以及基因治疗研究。一般而言，进行RNAi，首先需要将合成的siRNA转染至细胞或动物，或者将表达shRNA的质粒或重组病毒引入细胞或动物。目前已经阐明的是，外源合成的siRNA由于与经Dicer/TRBP剪切得来的内源miRNA十分相似，因此也具有基因沉默的功能，并可被装载进入RISC(见下图)。同样，shRNA和pre-miRNA在功能上也是类似的。在人为设计下，外源siRNA以及shRNA与它们的靶mRNA完全互补，从而直接导致靶mRNA的降解。
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miRNA与癌症：诊断、预后及治疗前景
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近年不断涌现对miRNA进行高通量检测的相关技术，比如miRNA芯片、磁珠流式细胞miRNA表达谱检测、定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)[等。这些高通量检测技术证明不同癌症组织内miRNA的丰度具有很大的差异。有趣的是，与正常组织相比，肿瘤组织内大部分miRNA的表达下降。这些研究结果表明，miRNA表达谱的研究可以用于鉴别正常组织和肿瘤组织、发育谱系以及分化组织。在肿瘤发生过程中进行miRNA表达谱的鉴定有利于发现基因治疗的新靶点，并提高疾病诊断和预后的正确性。
对于肿瘤组织中表达下降的miRNA而言，这种差异表达与癌症发生之间的关系还没有确定。但是， 已有令人信服的证据表明某些miRNA会直接参与癌症的形成。这些miRNA具有类似癌基因的功能。这些被称作“oncomiR”的mRNA，部分具有肿瘤抑制基因的功能，如miR-15a和miR-16-1以及miRNA的let-7家族成员的功能； 部分具有肿瘤癌基因的功能，如miR-17–92簇、miR-155以及miR-21。
首个肿瘤抑制基因miRNA是在慢性淋巴细胞白血病患者的B细胞中被发现的。miR-15a和miR-16-1成簇定位于染色体13q14上，但在慢性淋巴细胞白血病患者中，有超过一半的病例为miR-15a和miR-16-1表达缺失的。之后的研究表明，miR-15a和miR-16-1可下调抗凋亡基因Bcl2的表达。当研究人员发现在慢性淋巴细胞白血病病例中，miRNA往往位于染色体上经常出现缺失的区域后，便开始展开对位于“脆性位点”或容易发生染色体断裂、扩增及融合的位点的miRNA的研究。结果发现50%的miRNA位于脆性位点。这进一步证明了miRNA参与癌症发生， 且可作为基因治疗的有效靶点。有趣的是，Donsante等人发现腺伴随病相关的肝细胞癌是由于病毒载体在microRNA簇附近插入而导致的。
研究最为深入的致癌miRNA要数miR-17-92簇。miR-17-92簇基因位点在人B细胞淋巴瘤中出现扩增，因此miR-17-92簇在该肿瘤组织内相对正常的组织中表达上调。另外，研究者用小鼠B细胞淋巴瘤模型进行研究的结果表明，miR-17-92簇在c-Myc高表达环境下的过表达，加速了肿瘤的发展。另一个比较重要的致癌miRNA是miR-155。miR-155在多种类型的B细胞恶性肿瘤中有过表达。Costinean等人构建了一只B细胞内过表达miR-155的转基因小鼠。小鼠表现出多细胞性白血病前期前B细胞增殖情况，并随后出现恶性B淋巴细胞性肿瘤。这一结果有力支持了这一结论：miR-155直接参与了这些疾病的发生与发展。尽管上文仅仅从理论上阐述了一类miRNA参与癌细胞的发育的问题，但相关的深入研究将会对今后肿瘤的治疗产生深远影响。
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病毒与miRNAa3
越来越多证据表明病毒也具有miRNA的相关机制。对来自病毒感染性细胞的miRNA克隆的研究结果显示，很多DNA病毒都可对其自身miRNA进行编码。
到目前为止， 已发现11 种病毒可以编码自身miRNA(见the miRBase Sequence Database[previously the miRNA Registry], http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml)。这11种病毒分别为：Epstein-Barr病毒(EBV)、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、人巨细胞病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒1 (HIV-1)、卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、马立克氏病病毒(MDV)、马立克氏病病毒2(MDV-2)、小鼠γ疱疹病毒68 (MHV68)、恒河猴淋巴隐病毒、恒河猴Rhadino病毒以及猿猴病毒40(SV40)。这些病毒miRNA向我们展示了潜在的抗病毒靶点，并且这些miRNA可以作为病毒感染以及感染阶段或潜伏期诊断的标志。
病毒通过多种途径利用miRNA。例如，抑制病毒或宿主的基因转录，或者募集宿主miRNA进行病毒复制。EBV和SV40都可以编码以自身病毒转录产物为靶标的miRNA。EBV编码至少18个miRNA，其中一个miRNA以编码病毒聚合酶的转录产物为靶标，从而在之后的病毒感染中下调该酶。与此类似，SV40编码两个病毒miRNA，以病毒T抗原转录产物为靶标。上述调节机制有利于病毒的免疫逃避(immuneevasion)。
HSV-1所编码的miRNA则以宿主转录产物为靶标。HSV-1潜伏相关转录物编码的miRNA以参与细胞凋亡的宿主转录物为靶标(转化生长因子β和母体抗果蝇基因复合物同源物3)。宿主miRNA同样可用于病毒复制及抗病毒防御。内源性miRNA如miR-122，对于丙型肝炎病毒的复制是必需的。下图显示的是miR-122与丙型肝炎病毒的5' UTR之间的相互作用。采用此策略抑制病毒在体内复制的可行性还需进一步的明确。灵长动物泡沫病毒1(PFV-1)含有内源性宿主miRNA、miR-32的靶mRNA。
有趣的是，PFV-1编码一种蛋白(Tas)，而这种蛋白有可能干扰宿主的miRNA通路。上述例子说明对miRNA过表达或缺失的研究有可能为我们带来新的抗病毒治疗手段。
至少有一种普遍采用的基因转移载体可以编码一种抑制miRNA通路传导的RNA。高表达的腺病毒的病毒相关I型(virus-associated尽管绝大多数miRNA相关的人类疾病都与肿瘤发生有关，但已有越来越多的证据表明miRNA同样参与其它多种疾病的形成。比如，在两个心脏肥大的小鼠模型中，发现了28 个miRNA的表达下调。miR-9和miR-128a则在阿茨海默氏病患者大脑内有过表达[55]。16种miRNA在精神分裂症患者的大脑内也呈现差异表达。另外，还有研究发现SLITRK1基因的3'UTR的一个突变增强了miR-189的抑制作用，这与儿童秽语多动综合征(Tourette'ssyndrome)的发生相关。type I, VAI)RNA经试验证实，是一种在miRNA通路中的竞争性抑制因子，它至少对通路内两个过程具有抑制作用。VAIRNA是Exportin-5和Dicer的竞争性抑制因子，而且由Dicer切割产生的小VAI RNA也被证明和RISC有关。上述研究发现都表明，在采用腺病毒载体的人类临床试验中，如有可能，需要将内源性miRNA通路的饱和情况考虑在内。
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其它miRNA相关疾病a4
尽管绝大多数miRNA相关的人类疾病都与肿瘤发生有关，但已有越来越多的证据表明miRNA同样参与其它多种疾病的形成。比如，在两个心脏肥大的小鼠模型中，发现了28 个miRNA的表达下调。miR-9和miR-128a则在阿茨海默氏病患者大脑内有过表达。16种miRNA在精神分裂症患者的大脑内也呈现差异表达。另外，还有研究发现SLITRK1基因的3'UTR的一个突变增强了miR-189的抑制作用，这与儿童秽语多动综合征(Tourette'ssyndrome)的发生相关。
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miRNA的治疗手段a5
众所周知，miRNA与各种遗传疾病相关，如癌症和一些由病毒感染引发的疾病，这就为各种疾病治疗提供了新的潜在靶标。一直以来人们都在尝试研究如何在体内特异地调节miRNA的水平。幸运的是，这么多年来在反义RNA、核酶以及一些基因治疗方法上取得的研究成果为体内研究miRNA提供了一个良好的技术平台。
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